הקיבוץ הראשון שעלה על הקרקע במסגרת תנועת 'הקיבוץ הדתי'. המייסדים היו צעירים מתנועת 'הפועל המזרחי' אשר השתייכו לשלוש קבוצות הכשרה : קבוצת רודגס מפתח תקווה, פלוגת כפר יעבץ וקבוצת שח"ל מרחובות. חברי שתי הקבוצות הראשונות היו מבוגרי תנועת 'ברית חלוצים דתיים' (בח"ד) בגרמניה. חברי הקבוצה השלישית עלו מפולין, ליטא ורומניה, והיו חברים בתנועות 'השומר הדתי' ו'החלוץ המזרחי'.

במרץ 1936 התישבה קבוצה של עשרה מחברי רודגס בחוות 'בית יהודה' ליד בית שאן. כעבור שבועות מעטים פרצו מאורעות 1936 וחברי הקבוצה התפנו לבית אלפא, שם הכשירו עצמם במשך שנה להתישבות באזור.

ב-30 ביוני 1937 עלו המייסדים על הקרקע בעמק בית שאן והקימו את קיבוץ טירת צבי במסגרת התישבות 'חומה ומגדל'. המייסדים בליווי מתנדבים מישובי הסביבה  ונוטרים יצאו מבית אלפא בשיירת משאיות עמוסה בחמרי בנין, כלי עבודה ואספקה.  הם התישבו בחוות א-זרעא שרכשה קק"ל ממוסה אל-עלמי, חבר הוועד הערבי העליון. באתר היה בנין בן שתי קומות מלבני בוץ ('הטירה') וסביבו חומה מלבני בוץ. המתנדבים התקינו גדרות תיל מסביב לחומה, חפרו תעלות ובנו עמדות. בחצר הטירה נבנה מחנה אוהלים לשיכון החברים ועל גג הטירה הוצב זרקור שהאיר את הסביבה. הקיבוץ נקרא על שם הרב צבי קלישר, ממבשרי הציונות ומראשי 'חיבת ציון', ועל שם הטירה שהיתה במקום.

לאחר העליה על הקרקע החלו החברים בהכשרת הקרקע, בהסדרת המעיינות וביבוש הביצות באזור. המתישבים נאלצו להתמודד עם תנאי שטח ואקלים קשים ביותר, עם בעיות תחבורה, עם מחלת המלריה שתקפה רבים מהם ועם התנכלויות של ערביי הסביבה. ב-28 בפברואר 1938 הותקפה טירת צבי על ידי עשרות ערבים אשר הגיעו עד לחומות הטירה. המגינים הצליחו להדוף את התוקפים באמצעות ירי והשלכת רימונים.

בשנים הבאות הושקעו מאמצים גדולים בשמירה ובביטחון, במקביל לנסיונות לפתח ענפים חקלאיים. למרות הקשיים הצליח הקיבוץ לגדול ולהתרחב. בשנת 1946, במטרה להרחיב את אפשרויות הפרנסה, הוקם מפעל 'טיב טירת צבי' למוצרי בשר.

בטירת צבי, ראשון הקיבוצים הדתיים, עברו קבוצות רבות של חניכי 'בני עקיבא' ועולים מחו"ל אשר קיבלו הכשרה להתישבות. בסמוך לטירת צבי נבנו קיבוצים דתיים נוספים: שדה אליהו ועין הנצי"ב. לאחר מלחמת העולם השניה הצטרפה לקיבוץ קבוצה של בוגרי בח"ד מגרמניה, אשר שהו באנגליה בתקופת המלחמה. במהלך השנים נקלטו בקיבוץ עולים מצפון אמריקה וגרעיני נח"ל של 'בני עקיבא' מישראל: 'גאולים' (1955), 'נחלים' (1960), 'שח"ל' (1966), 'יחדיו' (1971), 'צורים' (1974), 'כיסופים' (1979).

עם קבלת החלטת החלוקה באו"ם בנובמבר 1947 החמיר המצב הבטחוני באזור. התחבורה התנהלה במשוריינים בליווי נוטרים. מאמצים רבים הושקעו בהקמת ביצורים ובאימונים. ב-16 בפברואר 1948 הותקפה טירת צבי על ידי כ-600 מחיילי 'צבא ההצלה' הערבי. התוקפים הפגיזו את הקיבוץ והסתערו עליו מכמה כיוונים אולם נהדפו בידי המגינים ועזבו את האזור.

לאחר סיום מלחמת העצמאות ההחלה תנופת פיתוח במשק החקלאי שכלל גידולי פלחה, ירקות, כרמי ענבים וזיתים, מטעי רימונים ותמרים. החלו להתפתח גם ענפי הלול, הרפת והמדגה. בשנת 1952 נסלל הכביש לבית שאן שהקל על התחבורה לקיבוץ. רפת החלב לא הצליחה ונסגרה בשנת 1959. גם ענף גידול בקר לבשר, שהחליף את רפת החלב, לא הצליח ונסגר בשנת 1969.

במלחמת ששת הימים הופגזה טירת צבי במשך היומיים הראשונים. בתקופת מלחמת ההתשה סבל הקיבוץ מהפגזות ומפעילות מחבלים.

כיום ענפי המשק בקיבוץ הם: חקלאות (מדגה, מטעי תמרים, ירקות, גידולי שדה, הודים), תעשיה (מפעל 'טיב טירת צבי למוצרי בשר ונקניקים), תיירות (חדרי אירוח, הדרכת טיולים, שרותי קייטרינג) ועסקים קטנים. הקיבוץ עובד תהליכי הפרטה ושינוי אורחות החיים. בסמוך לקיבוץ נבנית הרחבה קהילתית.